線粒體提取試劑盒從細胞裂解到高純度分離的全流程操作密碼
一、試劑盒使用前準備
試劑與耗材檢查
確認試劑盒組分完整（如裂解液、緩沖液、蛋白酶抑制劑、離心管、移液器吸頭等），檢查試劑有效期及儲存條件（如4℃冷藏或-20℃冷凍）。
準備輔助設備：低溫高速離心機（需預冷至4℃）、冰浴、恒溫金屬浴、細胞計數儀、微量移液器（量程覆蓋0.5-1000μL）、無菌操作臺。
預配溶液：按說明書稀釋裂解液，加入蛋白酶抑制劑（如PMSF至終濃度1mM），避免蛋白降解。
細胞樣本處理
細胞類型適配：哺乳動物細胞需胰酶消化后離心收集；組織樣本（如肝臟、肌肉）需先用手術剪剪碎，再用組織勻漿器研磨。
細胞計數與活力檢測：使用臺盼藍染色法確認細胞活力≥90%，避免死細胞釋放的酶類干擾線粒體純度。
二、線粒體提取試劑盒核心操作流程與規范
細胞裂解與線粒體釋放
溫和裂解：將細胞沉淀重懸于預冷的裂解緩沖液中，冰上孵育10-15分鐘，期間輕柔吹打3-5次，避免劇烈振蕩導致線粒體破碎。
差速離心分離：
第一步離心（低速）：1000-1500×g，4℃，5-10分鐘，去除細胞核及未裂解細胞。
第二步離心（高速）：10,000-15,000×g，4℃，10-15分鐘，沉淀線粒體，上清液為細胞質組分。
洗滌與重懸：用線粒體洗滌緩沖液（如含0.25M蔗糖的PBS）輕柔重懸線粒體沉淀，重復離心1-2次以去除雜質。
線粒體純度驗證與質量控制
形態學驗證：透射電鏡觀察線粒體雙層膜結構及嵴形態，確認無細胞碎片或細胞器污染。
功能驗證：
呼吸鏈酶活性檢測（如細胞色素c氧化酶活性），使用分光光度計監測550nm處吸光度變化。
線粒體膜電位檢測（如JC-1染料法），熒光顯微鏡觀察紅色/綠色熒光比值，評估線粒體功能完整性。
蛋白定量：提取線粒體蛋白后，用BCA法測定濃度，通過特異性抗體檢測線粒體標志蛋白，排除細胞質污染。
儲存與穩定性
短期儲存：線粒體懸液可置于冰上2-4小時，或4℃保存不超過24小時。
長期儲存：分裝后置于-80℃超低溫冰箱，避免反復凍融導致活性喪失。添加10%甘油作為保護劑，可延長保存期限至6個月。
三、關鍵注意事項與安全防護
操作溫度控制
全程在4℃冰浴或冷室中操作，避免線粒體酶活性因溫度升高而降解。離心機需提前預冷至4℃，減少溫度波動對線粒體的影響。
避免機械損傷
移液、混勻時使用寬口吸頭或剪尖吸頭，避免剪切力破壞線粒體結構。離心后輕柔倒出上清液，避免吸走沉淀。
污染防控
無菌操作：使用無菌試劑和耗材，在超凈臺內操作，防止細菌或真菌污染。
交叉污染防護：每步操作后更換吸頭，避免樣本間交叉污染。離心管需提前用75%乙醇擦拭消毒。
安全防護
操作人員需佩戴手套、口罩及護目鏡，避免直接接觸化學試劑（如裂解液中的去垢劑）。廢棄物需按生物安全規范處理，如高壓滅菌或化學消毒。
更新時間：2025-11-13
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